實時熒光定量PCR是一種在DNA擴增反應(yīng)中，以熒光化學(xué)物質(zhì)測每次聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法。通過內(nèi)參或者外參法對待測樣品中的特定DNA序列進行定量分析的方法。

　　熒光PCR方法檢測病原體已成為常規(guī)檢測技術(shù)，在工作過程中我們也遇到了各種各樣、千奇百怪的問題，那么在PCR儀出現(xiàn)故障的時候應(yīng)該怎么解決呢？

　　01反應(yīng)后反應(yīng)管壁出現(xiàn)液滴?

　　原因1：運行程序前沒有開啟熱蓋加熱功能

　　解決方法：開啟熱蓋加熱功能

　　原因2：反應(yīng)結(jié)束后低溫保存時間過久

　　解決方法：運行結(jié)束后，熱蓋將自動關(guān)閉，所以冷凝會自然出現(xiàn)，這不會對實驗結(jié)果產(chǎn)生影響，將反應(yīng)管置于離心機上瞬時離心機使液滴回到管子底部即可。

　　02反應(yīng)管氣泡在 PCR 反應(yīng)時，加熱破裂

　　反應(yīng)時在實驗過程中出現(xiàn)了氣泡，導(dǎo)致中途產(chǎn)生了較大的波動，其特點是單個樣本的幾個通道的熒光曲線同時在某個循環(huán)出現(xiàn)趨勢一致的波動。

　　分析原因：氣泡在 PCR 反應(yīng)的過程中被加熱，在某個時刻破裂，此時出現(xiàn)熒光擾動，在這個循環(huán)檢測到的熒光型號和上一個循環(huán)不一樣，此時如果波動位于基線期很可能就被軟件識別為開始擴增的拐點，擴增曲線就會產(chǎn)生結(jié)果。

　　03使用微孔板，

　　反應(yīng)后反應(yīng)液有明顯蒸發(fā)？

　　方法1：確保使用高質(zhì)量的微孔板，反應(yīng)前要嚴格密封；

　　方法2：確保蓋熱蓋，適當(dāng)提高熱蓋的溫度；

　　方法3：增大反應(yīng)體積。

　　04使用PCR管，

　　反應(yīng)后PCR的管內(nèi)反應(yīng)液有明顯蒸發(fā)？

　　方法1：確保使用高質(zhì)量的PCR管；

　　方法2：在樣品臺的四角放置四個同樣的空PCR管，以保證熱蓋壓在哥PCR管上的壓力均勻。

　　05PCR實驗結(jié)束后，

　　樣品可以一直放在PCR儀中低溫保存嘛？

　　當(dāng)程序運行結(jié)束后，及時取出樣品并停止儀器運行，而不要把儀器當(dāng)“冰箱”使用，低溫保存時溫度盡量設(shè)定得比較高，如8℃，這可以延長儀器的使用壽命。